研究蛋白質(zhì)功能、生產(chǎn)功能型蛋白質(zhì)基本都離不開蛋白質(zhì)的異源表達(dá)及純化，今天小編將從以下幾個(gè)方面與大家聊一聊蛋白質(zhì)表達(dá)、純化的那些事。

1、 標(biāo)簽選擇

目前常見的表達(dá)標(biāo)簽有His-tag（組氨酸標(biāo)簽）、GST-tag（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽）、MBP-tag（麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽）、CBD-tag（幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)標(biāo)簽）等。每種標(biāo)簽都具有*的性質(zhì)，比如標(biāo)簽的分子量、對蛋白可溶性的調(diào)節(jié)能力、對蛋白折疊的影響、是否需切除等。根據(jù)自己要純化的蛋白的特性，選擇合適的標(biāo)簽。標(biāo)簽選的好，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)事半功倍。

2、 載體構(gòu)建

選好要用的標(biāo)簽后，就要準(zhǔn)備構(gòu)建表達(dá)載體了。目前已有很多商品化的載體可供選擇，例如帶His-tag的pET28系列，帶MBP-tag的pMAL系列等。絕大多數(shù)的載體系列，都包含了標(biāo)簽插入N端或C端的形式，可以根據(jù)自己的蛋白的特質(zhì)進(jìn)行靈活選擇。插入蛋白的編碼基因時(shí)需要注意，不要出現(xiàn)移碼。如果想要自己從頭構(gòu)建載體，別忘了插入合適的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。啟動子序列一般使用誘導(dǎo)型啟動子，組成型啟動子會導(dǎo)致外源蛋白過早表達(dá)積累，不利于宿主增殖。

3、 宿主選擇

常見的宿主有大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞、酵母以及昆蟲。以大腸桿菌來說，適合做異源表達(dá)的菌株為BL21及其衍生菌株，但仍需要根據(jù)載體中選擇的轉(zhuǎn)錄、翻譯元件來挑選。BL21中內(nèi)源性的蛋白酶基因缺失，因此是一種適合于外源蛋白表達(dá)的菌株，但是它沒有T7 RNA聚合酶，所以不能用于含T7啟動子蛋白表達(dá)；BL21(DE3)，在BL21的基礎(chǔ)上整合了T7噬菌體基因組，適合T7表達(dá)系統(tǒng)，如pET系列；BL21(DE3)PLySs，在BL21(DE3)基礎(chǔ)，附帶了T7溶菌酶基因，可以更為嚴(yán)謹(jǐn)控制T7聚合酶的表達(dá)。需要注意的是，由于核酸內(nèi)切酶（endA1）重組酶（recA1）等基因的存在，質(zhì)粒在BL21系列菌株中不那么穩(wěn)定，可能出現(xiàn)整合至基因組、丟失、突變等現(xiàn)象，所以構(gòu)建好的載體仍需保存在DH5α之類的菌株中。

4、 培養(yǎng)條件優(yōu)化

以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為例，菌種復(fù)蘇和種子培養(yǎng)時(shí)都可以使用LB培養(yǎng)基，在發(fā)酵階段使用氨基酸含量更高但糖源更低的培養(yǎng)基則更好，如TB培養(yǎng)基，以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和積累。如果使用的是誘導(dǎo)型的啟動子，則應(yīng)在菌體生長至對數(shù)生長期后期時(shí)加入IPTG之類的誘導(dǎo)劑。加入誘導(dǎo)劑后，培養(yǎng)溫度需要調(diào)低至16-30℃。培養(yǎng)溫度越低，蛋白質(zhì)累積的越慢，越不容易產(chǎn)生包涵體。

5、 純化柱料選擇

每一種標(biāo)簽都有對應(yīng)的純化柱料。GST-tag使用谷胱甘肽凝膠，MBP-tag使用多糖樹脂，CBD-tag使用幾丁質(zhì)樹脂，His-tag則使用偶聯(lián)了二價(jià)金屬離子的填料，其中常見的是偶聯(lián)鎳離子的，俗稱鎳柱。

NEBExpress鎳柱填料（S1428S）于2019年11月全新上市，另有預(yù)裝離心柱形式（S1427S/L)，更適合做篩選階段的小量蛋白純化，純化1mg His標(biāo)記的蛋白質(zhì)，只要15分鐘。

每 1 ml 鎳柱填料可純化≥10 mg 組氨酸標(biāo)簽蛋白；

高特異性結(jié)合帶有His-tag的蛋白質(zhì)，分離和純化后純度>95％；

牢固的鎳離子結(jié)合使其對 EDTA 和還原劑有*的耐受性，與常見的基于去污劑的細(xì)胞裂解試劑兼容。